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Qiagen DNeasy Tissue Kit を用いたシラミからの DNA 抽出

吉澤和徳（北大・農・昆虫体系）

2002.6.7

用途：シーケンス解析

○試薬

• ATL buffer（キット付属）
• AL buffer（キット付属）
• AW1 buffer（キット付属：規定量の 99.5% EtOH を加えておく）
• AW2 buffer（キット付属：規定量の 99.5% EtOH を加えておく）
• AE buffer（キット付属）
• Proteinase K（キット付属）
• 99.5% EtOH

○プロトコル

1. サンプル一個体をキムワイプに乗せ，双眼実体下でピンセットを用い，腹部を頭・胸部から外す．解剖に用いたピンセットは，その都度アルコールを含ませたキムワイプでぬぐった後，ライターやアルコールランプ等で焙る．
2. 解剖したサンプルを 1.5 ml チューブに入れ，180 ul の ATL buffer を加える．
3. 20 ul の Proteinase K を加え，voltex した後，55C で二晩培養する．培養中，数度 voltex する（最低，培養開始１時間後，３時間後，翌朝：ローターで回し続ければベスト）．
4. 200 ul の AL buffer を加えて 10 秒間 voltex した後，70C で 10 分間培養する．
5. 210 ul の 99.5 % EtOH を加え，30 秒間 voltex する．
6. QIAamp spin column を添付の 2 ml collection tube に立て，溶液を移す．この際，1.5 ml チューブにサンプルの外骨格を残しておき，証拠標本としてプレパラートを作成する．
7. ６の 2 ml collection tube を 8000rpm で 1 分間遠心する．
8. collection tube を交換し，spin column に 500 ul の AW 1 buffer を加え，8000 rpm で 1 分遠心．
9. collection tube を交換し，spin column に 500 ul の AW 2 buffer を加え，15000 rpm で 3 分遠心．
10. spin column を 1.5 ml チューブに立て， AE buffer を 30 - 100 ul 加え，8000rpm で 1 分間遠心し，DNA を溶出する．

○ぽいんと

• 大型の昆虫では，筋肉組織の一部等を用いて抽出を行えますので，上記方法は意味がありません．Qiagen のプロトコル通りでいいでしょう．
• 微小昆虫では，標本をすりつぶすと DNA を抽出した個体の証拠標本が残りませんが，この方法だと，重要な分類形質を観察できる，非常にきれいな証拠標本を残す事が出来ます．
• タイトルにはシラミと書いてありますが，他の昆虫でも応用可能です．上記１では，腹部を頭・胸部から外すと書きましたが，重要な分類形質を壊さず，かつ体内から DNA がうまく溶け出るような部分であれば，どこを外しても構いません．
• 微量のサンプルのため，スメアをとっても何もでない事も多いですが，PCR は問題なくできます．

Ref.

もしここに書かれた方法を引用される場合，以下の論文を引用してください．
Cruickshank, R.H., Johnson, K.P., Smith, V.S., Adams, R.J., Clayton, D.H. & Page, R.D.M. 2001. Phylogenetic analysis of partioal sequences of Elongation Factor 1a identifies major groups of lice (Insecta: Phthiraptera). Molecular Phylogenetics and Evolution 19: 202-205.